Integrando conhecimentos em uma escola técnica federal: aprendendo a utilizar ferramentas tecnológicas e conceitos matemáticos nos mistérios da expressão de genes

Luciana Ferrari Espindola Cabral

Mestre em Botânica, docente (Cefet-RJ, Uned Maria da Graça)

Alan Nunes de Albuquerque

Estudante do curso técnico em Segurança do Trabalho (Cefet-RJ, Uned Maria da Graça)

Thays Meirelles Borges de Azevedo

Estudante do curso técnico em Segurança do Trabalho (Cefet-RJ, Uned Maria da Graça)

Larissa Brillo Nunes Rubio

Estudante do curso técnico em Segurança do Trabalho (Cefet-RJ, Uned Maria da Graça)

Fabiana Cordeiro

Doutora em Microbiologia,  docente, coordenadora do Ensino Médio Integrado (Cefet-RJ, Uned Maria da Graça)

Introdução

O DNA ou ADN (ácido desoxirribonucleico) carrega nossas informações genéticas e em sua estrutura são encontrados os nucleotídeos, que são compostos por bases nitrogenadas (adenina, timina, citosina e guanina), além de um açúcar (a desoxirribose) e um grupamento fosfato. Os genes são unidades compostas por DNA, possuindo a função de transmissão das características hereditárias; é importante ressaltar que cada um deles codifica uma determinada cadeia polipeptídica ou RNA funcional e é responsável pela geração de uma característica ou pela realização de determinada função dentro da célula.

Sabendo disso, o que é a expressão gênica e qual a relação deste artigo com esse conceito? Primeiro: a expressão gênica consiste na produção de RNAm (RNA mensageiro), conhecida como transcrição, e a posterior síntese da proteína chamada tradução.

Vandesompele et al. (2002) afirmam que

analisar a expressão gênica é importante em muitos campos da pesquisa em Biologia. Entender padrões dos genes expressos é importante para elucidar mecanismos regulatórios e levar a identificação de genes relevantes a novos processos biológicos ou implicados em doenças.

Em 1993, Kary Mullis ganhou o Prêmio Nobel de Química por desenvolver a técnica conhecida como Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), em que é utilizado um equipamento capaz de amplificar in vitro sequências de DNA curtas, utilizando variações de temperatura e fragmentos de DNA sintetizados em laboratório, chamados iniciadores ou primers (em inglês).

Os pesquisadores trabalham com a ferramenta denominada Reação em Cadeia da Polimerase de Tempo Real (RT-PCR), que consiste em amplificar o DNA cópia de uma sequência específica e quantificar a expressão do produto durante o progresso da PCR, utilizando um termociclador capaz de medir a fluorescência emitida quando o DNA é amplificado. O DNA cópia é obtido utilizando uma enzima especial, a transcriptase reversa, que converte o RNAm em cDNA (DNA cópia). A quantificação acontece por meio de fluorescência, dentro do sistema que utiliza sondas (que emitem fluorescência) e bloqueadores de fluorescência (chamados de quencher) ou intercalante (molécula que se liga ao DNA de fita dupla, ou seja, amplificado).

Figura 1:  Mecanismos de anelamento de primers e sondas em uma reação de PCR em tempo real. O R da figura é a molécula que emite a fluorescência e está ligado fisicamente com o quencher em 1. Nessa configuração, o quencher bloqueia a emissão da fluorescência. Em 2, quando a sonda e o primer se combinam com a cadeia de DNA, inicia-se um processo de liberação de primer e sonda, que pode ser visualizado em 3. Uma vez livre o R (chamado de repórter), pode emitir a fluorescência que é detectada pelo termociclador real-time
Fonte: Fabiana Cordeiro (2017).

Existem dois métodos de quantificação: a absoluta e a relativa. Na absoluta, o pesquisador é capaz de determinar exatamente, por exemplo, quantas cópias de um vírus existem na amostra. Na quantificação relativa, determinamos mudanças na expressão de um gene em uma dada amostra em relação a uma amostra de referência. Este método inclui Ct (ΔΔCt) comparativo e quantificação relativa, em que determinamos quanto daquele gene é expresso em relação a outro tem em cada amostra. Esse método utiliza uma amostra calibradora para comparação (Veja em: http://www.dorak.info/genetics/realtime.html). O Ct (Ciclo Threshold) reflete o número do ciclo no qual a fluorescência gerada em uma reação cruza o threshold.  Na prática, reflete o número de amplicons que foram acumulados.

A estratégia de cálculo que será utilizada neste caso para quantificação relativa é o método CT comparativo, em que se aplica a fórmula aritmética 2^-ΔΔCT  com o fim de comparar mudanças na expressão de genes.

Anteriormente a ela, deve-se estabelecer uma relação entre o gene alvo a ser analisado e o controle endógeno ¹ que serve como referência ativa para normalizar os valores de quantificação; este é um gene utilizado para normalizar a quantificação de um RNA mensageiro alvo para corrigir a quantidade de RNA adicionada à reação. Após a subtração do CT alvo ² com o CT endógeno ³ obtém-se o ΔCT que servirá para ser comparado com o ΔCT calibrador ⁴ referente à amostra calibradora escolhida, utilizada para comparar a expressão gênica entre amostras. Dessa comparação será obtido o ΔΔCT que será o recurso utilizado para diferenciar a expressão gênica nas situações em estudo.

Logo, o propósito deste material é entender o processo de expressão gênica de forma didática e como ele pode ser utilizado laboratorialmente para detectar a expressão de determinado gene. Para facilitar esse processo, propomos a utilização de um estudo de caso hipotético  de três surtos causado por bactéria E.coli O157:H7, que produz a toxina Stx, que se liga a receptores das células renais, paralisando e causando a necrose dos rins. Para esse fim, o aluno será o pesquisador-investigador que receberá três hambúrgueres de redes de fast food de três cidades diferentes; em cada uma, a toxina agiu de uma forma, causando mais ou menos mortes.

Desenvolvimento

O aluno será o pesquisador e receberá informações sobre hambúrgueres de três cidades diferentes: Rio de Janeiro, Porto Seguro, e Sakai, no Japão. Em Porto Seguro, foi informado ao aluno/aluna que foram registradas mortes relacionadas à doença com paralisia da função renal.

Após confirmar que a bactéria envolvida é a E.coli O157:H7, o pesquisador resolveu estudar a presença da toxina Stx2a, que paralisa a função renal. Ele deverá utilizar diversos bancos de dados; o principal utilizado para obtenção de resultados e realização de simulações é o site do NCBI (National Center for Biotechnology Information).

Para realizar a PCR em tempo real, já que o pesquisador quer ver a expressão diferencial da toxina nos três surtos, é necessário que tenha determinado diversos parâmetros (descritos mais à frente) e tenha posse do material necessário. Utilizando o site NCBI, ele deve determinar quais serão os primers e sondas do gene alvo e do controle endógeno.

Primer, também conhecido como iniciador, é o dispositivo utilizado na PCR para sintetizar a sequência alvo selecionada; para isso há o forward primer (5' - 3'), que segue o sentido normal de síntese da cadeia (Figura 1), e o reverse primer, seguindo o sentido inverso. A região flanqueada pelos dois primers (o forward e o reverse) é que vai determinar a sequência de DNA a ser amplificada.

Atividade 1: Achando sequências no NCBI

O procedimento para determinação de primers e sondas para a toxina que se quer pesquisar segue a seguinte ordem:

1) Acessar o site NCBI, no link https://www.ncbi.nlm.nih.gov/; ao lado do campo de pesquisa, deve-se selecionar o objeto específico de procura; neste caso, gene, após digitar o nome da toxina "stx2A" no campo de pesquisa.

Figura 2: Passo a passo de obtenção de sequências no site NCBI

Figura 3: Achando a sequência específica da toxina

2) Procurar o código ID: 1262249 (referente a E.coli O157:H7) e selecionar o gene referente a ele; diversos dados serão mostrados, mas para determinar os primers deve-se selecionar a opção FASTA, em que é mostrada a sequência específica do gene stx2a, ao lado selecionar a opção "pick primers".

3) Uma caixa para preenchimento de dados é mostrada; é necessário modificar apenas o valor máximo da caixa "PCR product size" para até 150pb o amplicon ⁵ e mudar a pesquisa da caixa "Database" para "nr" em seguida selecionar "Get primers"; então selecionar a caixa ao lado da sequência AP000422.1 e clicar em Submit no final da página. O primer a ser selecionado é o mostrado em "Primer pair 1". O pesquisador utilizará as sequências apresentadas pelo programa: GGACCACATCGGTGTCTGTT (forward primer) e ATTAACGAACCCGGCCACAT (reverse primer), que corresponderão ao primer/iniciador específico da toxina.

Figura 6: Como desenhar primers (forward e reverse) utilizando a base de dados NCBI, respeitando os critérios dados pelo real time.

O pesquisador deve repetir o procedimento acima para o controle endógeno pesquisando por "O157:H7 16S", apenas levando em consideração que o código do gene a ser selecionado nesse caso é ID: 914974, sendo escolhido o gene rrsB (16s; controle endógeno). O primer a ser selecionado segue o esquema citado; as sequências apresentadas pelo programa são GGCGCATACAAAGAGAAGCG (forward primer) e CTCCAATCCGGACTACGACG (reverse primer).

Para determinação das sondas de ambos (gene alvo e controle endógeno), o  processo a ser seguido envolve algumas regras: uma sonda deve estar situada próximo ao primer forward (distância de geralmente 1 a 5 bases); em geral, o conteúdo de guaninas e citosinas da sonda deve estar entre 35 e 65% e não se deve ter uma guanina no final 5' (próximo ao fluorocromo reporter) da sonda (Dorak, 2006). Todo esse processo será realizado manualmente, ou seja, o pesquisador deverá, a partir das sequências dos genes stx2a e 16S, localizar os primers determinados anteriormente e determinar as sondas, sendo elas: TATCAGTGCC para o gene alvo e CTGCCAGTGA para o controle endógeno (16S).

Determinados os primers e sondas, o próximo processo a ser feito é a conversão de RNA em cDNA. Para que esse processo ocorra, é necessário que haja primeiramente a extração do RNA alvo; no caso deste experimento, os RNAs dos três hambúrgueres relativos a cada um dos surtos hipotéticos. Após a extração, o RNA é tratado com uma DNase I para eliminação de qualquer resquício de DNA genômico, é dosado e verificada sua qualidade e integridade. Além disso, é preciso dosar esse RNA, porque a mesma quantidade do material deve ser colocada entre as amostras para evitar variação de quantidade entre os materiais, o que levaria a erros de interpretação. Em seguida, como indicado na Figura 9, acontece o processo de conversão do RNA em cDNA, com posterior determinação da expressão do gene em um único tubo/etapa.

Figura 9: Inserção de RNA quantificado em um tubo, primer específico para gene alvo ou endógeno, enzima RT para converter RNA em DNA cópia; tampão; nucleotídeos e sondas específicas para cada iniciador. Em seguida, desnaturar (abrir) as fitas, parear os iniciadores/primers (caso haja correspondência) e extensão da cadeia
Fonte: Thays Azevedo (2017).

Atividade 2: Desvendando a expressão gênica

Trabalhando com os conceitos vistos, a amostra calibradora, que será utilizada para intuito de comparação, será a amostra 1 (do Rio de Janeiro). O aluno receberá do equipamento de real time, os seguintes resultados em triplicata (média + desvio padrão) de cada Ct:

Tabela 1: Resultados obtidos pelo PCR em tempo real (ou real-time PCR) para análise da expressão gênica

1) Calcular o ΔCt de cada um dos surtos, utilizando como parâmetro o fato de que o valor do Ct da toxina deve ser normalizado com o valor do Ct do 16S.

Resposta: na tabela.

2) Calcular o ΔCt (Ct-alvo-Ct-endógeno). Em seguida, calcular o ΔΔCt (ΔCt alvo normalizado - ΔCt calibrador). A fórmula 2^-ΔΔCt auxilia na conversão do resultado em unidades relativas de expressão.

Resposta: na tabela.

3) Responder com base nos resultados obtidos: por que o surto 2 causou mais mortes que os outros?

Resposta: Como a toxina foi expressa em muito maior quantidade no surto 2, provavelmente causou muitos danos ao hospedeiro, paralisando de forma muito eficiente a função renal.

Referências

DORAK, M.T. Real-Time PCR (Advanced Methods Series). Oxford: Taylor & Francis, 2006. Disponível em: http://www.dorak.info/genetics/realtime.html. Acesso em: set. 2017.

VANDESOMPELE, J. O.; DE PRETER, K.; PATTYN, F.; POPPE, B.; VAN ROY, N.; DE PAEPE, A.; SPELEMAN, F. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome biology, 18; 3(7), Research 0034, Epub jun. 18, 2002.

¹Controle endógeno: referência ativa que corrige pequenas diferenças de RNAm entre as amostras. Não deve variar em diferentes condições experimentais.

²Gene que se quer pesquisar.

³Referência ativa.

⁴Utilizada como base de comparação para verificar aumentos ou decréscimos de expressão. Como exemplo podemos comparar a expressão de determinado gene no cérebro (utilizando este como calibrador) e a expressão do mesmo gene no fígado.

⁵Amplicon: produto da amplificação de um gene dentro da sequência de primers (ou iniciadores) escolhida. Para real-time, é recomendável que esse amplicon tenha até 150 pares de bases.