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Contribuições da Biologia Molecular para a compreensão e prevenção de problemas genéticos

Mayana Zatz

Ciência e Saúde Coletiva. vol.7, no.1 São Paulo, 2002.

Introdução

Como o Projeto Genoma Humano vai influenciar nossas vidas? Como a medicina tem se beneficiado do estudo dos genes? O que existe de prático e o que se espera para o futuro? Você já se fez estas perguntas? Será que elas têm respostas?

O grande acontecimento do ano 2001 foi, sem dúvida, o anúncio de que o sequenciamento do Genoma Humano está quase completo. A mídia não se cansou de repetir que os conhecimentos gerados irão revolucionar a medicina. Entretanto, fala-se muito pouco a respeito das aplicações imediatas deste grande feito científico. Quais são as implicações éticas?

Na realidade, o anúncio do sequenciamento do genoma humano ainda não trouxe respostas para questões fundamentais como: Quantos genes temos na realidade? Será que são realmente 30.000, ou mais? Quantas proteínas são codificadas por estes genes? Como os genes interagem entre si e com o ambiente? Quanto os nossos genes determinam a nossa personalidade e o nosso comportamento? Cada questão respondida abre um leque de novas questões, inclusive do ponto de vista ético, como veremos a seguir com o exemplo das doenças neuromusculares. Ainda estamos na ponta do iceberg, mas a aventura promete ser fascinante.

Por outro lado, a biologia molecular tem contribuído de maneira significativa para a compreensão de como nossos genes funcionam quando normais e por que causam doenças quando alterados. Além disso, o diagnóstico molecular para um número crescente de patologias tem sido fantástico para evitar outros exames invasivos, identificar casais em risco e prevenir o nascimento de novos afetados (a partir do aconselhamento genético e do diagnóstico pré-natal). Entender como nossos genes funcionam é o primeiro passo para o tratamento dessas patologias. Mas enquanto buscamos a prevenção e obviamente a cura, temos também um compromisso ético em relação ao uso de testes genéticos que devem ser discutidos com os consulentes antes de serem realizados.

Compreensão de doenças hereditárias

As distrofias musculares progressivas

As distrofias musculares progressivas constituem um grupo de doenças, caracterizadas por uma degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética, e que tem sido objeto de muitas pesquisas. Já foram mapeados genes responsáveis por mais de 30 formas de distrofia, cuja herança pode ser autossômica dominante, autossômica recessiva e ligada ao X. Além disso, sabe-se que existem formas ainda não identificadas. Os avanços da biologia molecular na última década revolucionaram nossos conhecimentos e começam a responder perguntas fundamentais tais como: Qual é o defeito básico? O que leva os músculos a degenerar? Como explicar a heterogeneidade genética, isto é, como mutações em genes diferentes podem resultar em um mesmo fenótipo? Ou, ao contrário, como mutações em um mesmo gene podem levar a quadros clínicos diferentes? Por outro lado, a análise molecular levantou outras questões intrigantes. Por exemplo, tem-se observado em um número crescente de doenças que pacientes com a mesma mutação podem ter quadros clínicos totalmente diferentes (McNally et al., 1996; Passos-Bueno et al., 1999) ou que alguns genes autossômicos afetam mais um sexo do que o outro (Ikeuchi et al., 1996; Iughetti et al., 1996; Zatz et al., 1997; 1998). A explicação para estas observações, além de fascinante, será extremamente importante para futuros tratamentos.

As distrofias de Duchenne e Becker

Dentre as diferentes miopatias, a distrofia de Duchenne (DMD) de herança recessiva ligada ao cromossomo X é a mais comum, com uma incidência de 1 em cada 3.000 nascimentos de sexo masculino (Emery, 1993). Já a distrofia tipo Becker (DMB), alélica à DMD (isto é, localizada no mesmo loco que a DMD), é cerca de 10 vezes mais rara. A diferença entre essas duas formas está na idade de início e velocidade de progressão. Na DMD, os sinais clínicos iniciam-se entre 3-5 anos de idade (com quedas frequentes, dificuldades para subir escadas, correr e levantar do chão), o confinamento à cadeira de rodas se dá até os 12 anos de idade e os afetados raramente sobrevivem após a terceira década. Já na DMB, os sintomas iniciam-se em geral na segunda década, os afetados sempre andam após os 16 anos e a velocidade de progressão é extremamente variável. Cerca de 30-50% dos pacientes com DMD têm retardo mental cujas causam ainda estão sendo investigadas (Rapaport, 1991; Rapaport et al., 1992).

Pacientes com DMD e DMB têm um aumento significante (até 2.000 vezes os valores normais) da enzima creatino-quinase (CK) no soro sanguíneo que é liberada do músculo distrófico, mesmo antes do aparecimento dos sinais clínicos (Zatz et al., 1976; 2001). Entretanto, até a década de 1980, não se tinha ideia acerca do mecanismo molecular que causava estas distrofias e nem se a forma grave de Duchenne e a variante mais leve de Becker eram causadas por um único gene ou dois independentes.

Após a localização do gene da DMD/DMB no braço curto do cromossomo X, em 1981, do qual nosso grupo participou (Zatz et al., 1981), descobriu-se em 1984, que os genes da DMD e DMB eram alelos, isto é ocupavam o mesmo loco no cromossomo X. Mas foi só após a clonagem do gene DMD/DMB em 1987 (Koenig et al., 1987; 1989) que o produto gênico foi identificado: uma proteína do citoesqueleto da membrana, que foi denominada distrofina (Hoffman et al., 1987; 1988), e cuja função mais provável seria a de manter a estabilidade da membrana da célula muscular.

Hoje sabe-se que as mutações que causam DMD ou DMB são deleções no gene da distrofina em cerca de 60% dos casos, duplicações em 5-6% dos casos e mutações de ponto (em uma única base ou nucleotídeo do DNA) nos casos restantes (Koenig et al., 1989; Lindlöf et al., 1989). A diferença entre a DMD e a DMB depende da manutenção ou não do quadro de leitura do RNA mensageiro (RNAm). Na DMB, a deleção é em fase, isto é, o quadro de leitura do RNAm é mantido e tem-se como resultado uma proteína quantitativamente reduzida ou deletada internamente, mas em parte funcional. Já na DMD, a deleção é fora de fase, isto é, o quadro de leitura do RNAm não é mantido, tem-se uma proteína severamente truncada e que é rapidamente destruída pela célula (Monaco et al., 1988).

Aspectos genéticos

Cerca de 1/3 dos casos de DMD são causados por mutações novas (Zatz et al., 1977), e os restantes 2/3 são herdados de mães portadoras. A maioria (mais de 90%) das mulheres portadoras de mutações no gene da distrofina é assintomática (Emery, 1993). Entretanto tem um risco de 50% de passar o gene defeituoso para a sua descendência, isto é, metade dos filhos pode ser afetada e metade das filhas portadoras, porém clinicamente normais. Outro aspecto importante (observado por nosso grupo e pesquisadores da Holanda) é o mosaicismo gonadal. Isto é, aproximadamente 10% das mães de casos isolados de DMD, nas quais não foi detectada mutação no sangue periférico, podem ser portadoras da mutação na linhagem germinativa (Passos-Bueno et al., 1990; 1992). Estas mulheres têm um risco aumentado de vir a ter filhos afetados pela DMD.

Diagnóstico e aconselhamento genético

Diagnóstico

O exame de DNA em sangue periférico (ou em raspado de mucosa bucal) tem sido muito importante para o diagnóstico, evitando, em muitos casos, a realização de exames invasivos como a biopsia muscular ou a eletroneuromiografia (que além de ser um exame doloroso não auxilia no diagnóstico diferencial entre as várias formas de distrofias). Do ponto de vista prático, em casos suspeitos os passos a serem seguidos para o diagnóstico são os seguintes:

  1. Dosagem de CK no soro: se aumentado sugere o diagnóstico de distrofia muscular (Zatz et al.,1976).
  2. Análise de DNA: pesquisa de deleção no gene da distrofina; se for encontrada deleção confirma-se o diagnóstico de DMD/DMB.
  3. Biopsia muscular: é indicada se não for encontrada deleção no gene da distrofina, se não houver história familiar de herança recessiva ligada ao cromossomo X ou em crianças que são casos isolados, nas fases iniciais, para um diagnóstico diferencial entre DMD e DMB. A primeira proteína a ser pesquisada é a distrofina, pela técnica de imunofluorescência e western blot (Vainzof et al., 1990; 1993a). Os possíveis resultados são:
    1. distrofina ausente: confirma-se o diagnóstico de distrofia de Duchenne;
    2. distrofina quantitativamente diminuída ou com peso molecular diminuído (através de análise por western blot): o diagnóstico de distrofia tipo Becker é o mais provável;
    3. distrofina normal: pode tratar-se de distrofia tipo cinturas ou outra forma de distrofia muscular. O passo seguinte é analisar as diferentes proteínas associadas às formas autossômicas recessivas tais como as sarcoglicanas, a calpaina-3, a disferlina, a teletonina em biopsia muscular (Anderson et al., 1998; 1999; Spencer et al., 1997; Vainzof et al., 1996).

Estimativas de riscos genéticos

Para identificação de portadoras e estimativas de riscos genéticos os passos a serem seguidos são:

  1. O paciente é caso isolado e tem deleção no gene da distrofina.
    1. Se a mãe (e/ou irmã do afetado) for portadora da deleção confirma-se que é (são) heterozigota(s). Neste caso há risco de 50% de vir a ter filhos afetados e filhas portadoras. É possível realizar diagnóstico pré-natal de certeza através da análise de DNA extraído de vilosidades coriônicas, ao redor de 10 semanas de gestação.
    2. Se a mãe não tiver deleção em sangue periférico existe ainda um risco de mosaicismo gonadal que varia de acordo com o sítio da deleção (Passos-Bueno et al., 1992). Se for no início do gene, o risco para um feto de sexo masculino é de cerca de 15%; se for na região central do gene, o risco para um feto de sexo masculino é de cerca de 2%.
    3. Se uma irmã de afetado não tiver deleção em sangue periférico, o risco de que seja portadora é desprezível.
  2. O paciente é caso isolado e não tem deleção no gene da distrofina.
    Nestes casos compara-se o cromossomo X (através de marcadores polimórficos de DNA ao longo do gene da distrofina) do afetado com outros indivíduos da genealogia. As pessoas a serem analisadas e a estimativa de risco genético dependem da estrutura da família.
  3. Existe história familiar compatível com herança ligada ao X.
    Nesta situação todas as mães de afetados são portadoras certas do gene (risco de 50% para descendentes de sexo masculino) e todas as irmãs têm risco de 50% de serem portadoras (Zatz et al., 1989). O exame de DNA a ser realizado vai depender da presença ou não de deleção no afetado.

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Publicado em 01 de janeiro de 2002