Quatro gerações de biotecnologias em reprodução animal

O princípio básico que rege a aplicação das biotécnicas de reprodução assistida em animais consiste em facilitar ou potencializar encontro entre gametas masculino e feminino para que ocorra a fertilização, que pode ocorrer no animal – in vivo, como em laboratório – in vitro. São técnicas que melhoram e viabilizam a fertilidade animal ou potencializam sua eficiência reprodutiva. Entretanto, para animais de interesse zootécnico, em que se busca cada vez mais a eficiência do processo reprodutivo e produtivo, essas biotecnologias são mais que um suporte para resolução de problemas com animais inférteis ou subférteis; elas são praticamente o único caminho viável para multiplicar o avanço do melhoramento genético de raças e espécies, viabilizar novas técnicas de manejo reprodutivo, além de promover novos modelos de produção pecuária mais sustentável, dentre inúmeros outros benefícios. Em geral, na escolha entre as diferentes biotécnicas de reprodução animal assistida, devem ser consideradas algumas variáveis:

1. Conhecimento científico sobre os índices de sucesso da biotecnologia para aquela espécie, raça e rebanho;
2. Objetivos desejados com o procedimento de reprodução assistida;
3. Habilidade e experiência da equipe que vai realizar a técnica;
4. Condições e equipamentos laboratoriais para realização do serviço;
5. Custo-benefício da aplicação da biotecnologia e o potencial de retorno financeiro futuro com a aplicação da tecnologia.

A tendência é sempre a escolha da técnica com melhor custo-benefício, o que nem sempre é a mais barata em termos de investimento, pois os procedimentos para algumas dessas técnicas são bastante caros e envolvem mão de obra altamente especializada. A seguir apresentamos um pouco das atualizações sobre o uso das principais biotecnologias aplicadas à reprodução animal criadas pelos cientistas nos últimos 70 anos, todas elas já com aplicações comerciais viáveis, principalmente para a espécie bovina, em que tais técnicas geram importantes impactos financeiros para a pecuária brasileira e mundial.

Primeira geração: inseminação artificial

Considerada uma biotecnologia de reprodução animal de primeira geração, a inseminação artificial (IA) é o processo de fecundação natural, porém no qual os espermatozoides são coletados e processados em laboratório para depois serem depositados em concentrações adequadas no útero da fêmea no momento o mais próximo possível da sua ovulação. Existe ainda a possibilidade de o sêmen ser congelado em nitrogênio liquido (-197º C), fazendo com que o material genético do macho possa ser preservado por anos ou décadas, mesmo depois de sua morte. A finalidade da IA é facilitar a chegada dos espermatozoides às trompas num número adequado para a fertilização dos ovócitos. Visando achar o melhor momento para inseminação artificial, o ciclo estral (animais) ou menstrual (mulher) precisa ser controlado e monitorado para uma correta sincronização do momento da IA, o que pode ocorrer por meio de exames ginecológicos com ou sem utilização da ultrassonografia ou com uso de terapias hormonais de controle do ciclo reprodutivo.

A inseminação artificial em humanos conseguiu popularidade nos anos 70 como tratamento de infertilidade humana. A técnica mais comum usada hoje em dia é a inseminação intrauterina (IUI), mais até do que a inseminação intracervical. O sucesso da inseminação artificial em humanos varia dependendo do tipo de problema de fertilidade. Na espécie humana, o uso dessa biotecnologia pode aumentar muito as chances de um casal com problemas reprodutivos ter um bebê.

Em outras espécies, como os bovinos, as técnicas de inseminação artificial se popularizaram na década de 1970, com desenvolvimento das biotécnicas associadas à preservação de gametas. Sua utilização foi imprescindível para a evolução genética e o melhoramento das raças bovinas de produção de leite e corte na atividade pecuária. Em diversas outras espécies, como suínos, ovinos, caprinos e equinos, essa técnica é também bastante utilizada nas práticas de manejo reprodutivo. Para os animais domésticos, essa técnica é considerada uma Biotecnologia de primeira geração (Gonçalves et al., 2008; Vieira, 2012), porém isso não quer dizer que ela esteja em desuso ou que foi substituída por outras biotecnologias. A inseminação artificial é a biotecnologia de maior utilização na grande maioria das espécies de interesse zootécnico, gerando impactos econômicos importantes.

Hoje, essa biotecnologia encontra-se largamente disseminada no Brasil para a espécie bovina, podendo ser realizada inclusive em pequenas propriedades sem representar custo adicional ao produtor; pelo contrário, essa técnica o faz economizar, evitando que precise ter reprodutores de alto valor na fazenda para coberturas, possibilita facilidade no cruzamento entre raças e melhorias de manejo sanitário, dentre diversas outras vantagens. Em animais de produção, as técnicas de IA apoiam imensamente os processos produtivos e a aceleração do melhoramento genético da espécie, ajudando a disseminar material genético de melhor qualidade enquanto potencializa sistemas de produção (Rodrigues; Rodrigues, 2009).

Segundo Baruselli et al. (2018), em 2018 houve 13,1% do total de matrizes do rebanho nacional acasaladas com uso da inseminação artificial, demonstrando significativo avanço na utilização dessa tecnologia na última década, pois em 2002 apenas 5,8% das matrizes do rebanho brasileiro eram inseminadas. Esse aumento ocorreu principalmente devido ao emprego dos novos protocolos e técnicas de inseminação artificial com tempo fixo – IATF, ou seja, sem a necessidade de observação do momento do estro. Essa técnica de IA, que sincroniza não somente o estro, mas também o momento da ovulação, através de tratamentos hormonais, apresenta elevada eficiência e melhores condições de manejo em fazendas extensivas; por isso facilitou a disseminação da inseminação artificial no Brasil na última década. Estima-se que em 2018 aproximadamente 9,5 milhões de fêmeas foram inseminadas artificialmente, contribuindo para elevar os ganhos genéticos, produtivos e econômicos da pecuária nacional, o que dá a dimensão comercial desse mercado. O Brasil possui várias centrais de inseminação artificial, em que os melhores reprodutores, do ponto de vista das provas genéticas, são levados para produzir milhares de doses de sêmen que serão utilizadas nas mais diversas fazendas e regiões do pais.

Em animais silvestres, a técnica pode ajudar na sobrevivência de animais em extinção e na realização de acasalamentos entre animais de diferentes regiões geográficas. Dependendo da espécie, as biotecnologias associadas ao processo de criopreservação dos gametas, manejo e manipulação hormonal estão mais dominadas e conhecidas ou ainda em estudo. Normalmente, espécies com menor pressão de seleção reprodutiva possuem mais problemas reprodutivos, havendo menos chances de sucesso também no uso da inseminação artificial para essas espécies (Hafez; Hafez, 2004).

As pesquisas sobre o processo de criopreservação de células e tecidos, com início na década de 1950, foram o fundamento científico que possibilitou a partir da década de 70 a criopreservação espermática, método que logo se consolidou entre os animais de interesse zootécnico, como os bovinos, possibilitando a difusão de reprodutores com qualidades genéticas superiores no mundo todo (Hafez; Hafez, 2004). Para a maioria das espécies em que se obteve sucesso com a criopreservação do sêmen em nitrogênio líquido, abriu-se a possibilidade para preservação de número ilimitado de doses de determinado reprodutor, desde que ele possua características de fertilidade e produção espermáticas normais. A partir de apenas um ejaculado é possível obter centenas de doses fecundantes do sêmen desse animal. Para a espécie bovina utilizada na pecuária de corte e leite, essa biotecnologia, também considerada de primeira geração, tornou-se uma indústria altamente lucrativa e útil aos pecuaristas.

Outro desenvolvimento tecnológico importante foi a capacidade de identificar e separar em laboratório os espermatozoides de cromossomo X e Y de um determinado ejaculado, técnica já padronizada e realizada com sucesso para a espécie bovina. Pela diferença de peso molecular entre espermatozoides X e Y (cerca de 3% menor), eles são corados de forma distinta. Ao passar por aparelho de citometria de fluxo, é possível identificar e carregar com cargas elétricas os diferentes espermatozoides X e Y que posteriormente serão atraídos para diferentes saídas do aparelho. Apesar de haver danos a alguns espermatozoides durante o processo, principalmente em nível da permeabilidade de membrana, a técnica já foi suficientemente ajustada para gerar boa produtividade de doses por ejaculado coletado, obtendo suficiente quantidade de espermatozoides por dose de sêmen produzido. Hoje a indústria brasileira já disponibiliza diversas opções para compra de doses de sêmen sexado de diversos reprodutores bovinos com garantia de até 90% de prenhez do sexo da cria (Morani et al., 2018).

Segunda geração: transferência de embriões in vivo (TE)

A biotecnologia de transferência de embriões consiste na produção in vivo do embrião, ou seja, a fecundação ocorre dentro do próprio sistema genital da fêmea, porém na sequência esse embrião será coletado ainda em estágio inicial de desenvolvimento para ser transferido para outra fêmea da mesma espécie, onde ocorrerá a gestação. Para espécie humana, essa técnica é popularmente conhecida como “barriga de aluguel”.

Em bovinos, a transferência de embriões é outra técnica dominada e foi muito utilizada comercialmente, pois pela manipulação hormonal de fêmea doadora de embriões é possível produzir em um curto período de tempo dezenas embriões viáveis, que nascerão todos no mesmo ano. Essa técnica multiplica em muitas vezes a capacidade de uma fêmea de alto potencial genético de gerar descendentes. Por exemplo, uma fêmea bovina em situações normais poderia ter no máximo entre 12 a 15 crias em toda sua vida reprodutiva; com o uso da transferência de embriões, poderá ter dezenas ou até centenas de crias por ano.

O primeiro passo para a realização da transferência de embriões em bovinos é provocar, por meio de aplicação de hormônios específicos, uma superovulação numa vaca de alto potencial genético. Esse processo de manipulação hormonal fará com que a fêmea, em vez de liberar apenas um ovócito (óvulo), o que seria o processo natural, libere vários óvulos ao mesmo tempo. O passo seguinte é inseminar artificialmente essa fêmea gerando múltiplos embriões e, sete dias depois, fazer uma lavagem uterina para recolher esses embriões em desenvolvimento precoce. Em laboratório, os embriões viáveis serão identificados, classificados e separados. A partir daí, serão transferidos imediatamente para o útero de outras fêmeas que atuam como "barrigas de aluguel", ou seja, serão as que irão apenas gestar o embrião, sem contribuir com sua genética.
Dentre as biotecnologias associadas a essa tecnologia está também a de criopreservação de embriões em nitrogênio líquido, possibilitando a preservação desse material genético completo (embrião fecundado) por tempo indeterminado.

É importante ressaltar que as “receptoras” devem estar com o ciclo estral sincronizado com a fêmea “doadora”, para que fisiologicamente estejam aptas para prosseguir a gestação. Nesse modelo, a produção e a coleta de embriões em bovinos, por exemplo, podem ser realizadas a cada 60 dias, coletando-se entre 6 a 10 embriões viáveis por coleta. A taxa de concepção e aproveitamento é em torno de 50 a 60% dos embriões implantados com sucesso. É importante salientar, porém, que existem problemas com a constante superestimulação hormonal das fêmeas, que, além de apresentar problema, depois de determinado tempo passam a não responder adequadamente aos tratamentos hormonais.

A transferência de embriões in vivo foi, dessa forma, considerada uma biotecnologia de segunda geração, sendo bastante utilizada em diversas espécies (principalmente bovinos) em larga escala nas décadas de 1980, 1990 e 2000 (Vieira, 2012). Porém essa biotecnologia diminuiu muito seu apelo para o uso comercial na última década, perdendo espaço para as biotecnologias de terceira geração, associadas à fertilização in vitro (FIV). Os motivos para que a transferência de embriões produzidos em laboratório tivesse mais apelo comercial foi pelo fato de elas tornarem-se mais eficazes, produtivas, baratas, menos invasivas para o animal e de manejo mais prático para as fazendas do que a transferência de embriões in vivo. Segundo dados apresentados por Gonçalves e Viana (2019), o Brasil, em 2017, realizou 375.503 transferências de embriões da espécie bovina, sendo a maioria (mais de 90%) através da fertilização in vitro, uma técnica mais recente e complexa, porém com maior efetividade de embriões produzidos do que a fertilização in vivo com posterior transferência.

Terceira geração: fertilização in vitro (FIV)

A fertilização in vitro é um procedimento no qual se promove o encontro do espermatozoide com o ovócito em laboratório, ou seja, fora do ambiente uterino da fêmea. Esse método foi apresentado pela primeira vez por Edwards e Steptoe para a espécie humana (Edwards; Steptoe, 1978). Basicamente consiste na punção dos folículos ovarianos, a fim de obter ovócitos para realizar fertilização no laboratório. Após 48 horas (em estágio de mórula inicial) é realizada a transferência intrauterina dos embriões. As indicações para FIV em seres humanos envolvem os casos de obstrução tubária bilateral, infertilidade devido a fator masculino, infertilidade sem causa aparente e causas de infertilidade que não responderam a outros tipos de tratamento. Em 1978, nasceu em Londres Louise Brown, que, graças aos trabalhos de Edwards e Steptoe, tornou-se o primeiro ser humano nascido de um ovócito fecundado em laboratório. A partir desse feito fundamental, apareceram novos recursos e técnicas que não apenas tentaram reparar os déficits de procriação como também deram origem a importantes aportes para o conhecimento da Fisiologia reprodutiva e impactos para a produtividade animal.

O processo de produção in vitro de embriões (PIVE) consiste nas seguintes etapas: a aspiração folicular para punção de ovócitos; a maturação com complexo cumulus-ovócito (MIV); a fecundação com espermatozoide em laboratório (FIV), o cultivo embrionário precoce (CIV) e a transferência final dos embriões produzidos para o útero das fêmeas receptoras sincronizadas (Palhano et al., 2008; Gonçalves et al., 2008).

Apesar de a aspiração folicular também acontecer em ovários de matadouros, para o uso comercial a técnica de coleta de oócitos em animais vivos, sem a necessidade da extração dos ovários, só aconteceu com o advento das técnicas de ultrassonografia para inspeção do trato reprodutivo de diversas espécies. Hoje é possível realizar a coleta de oócitos em diversas espécies com o procedimento ovum pick up (OPU). A punção dos folículos se dá por aspiração do conteúdo de cada um dos folículos acima de 3 a 4 mm com agulha guiada por ultrassonografia transvaginal, um procedimento pouco invasivo para o animal, com o mínimo de efeitos colaterais e boa produtividade em termos de oócitos coletados, em média de 15 a 20 por coleta (Gonçalves et al., 2008).

O fluido aspirado do folículo ovariano é examinado ao microscópio, com posterior cultivo em local apropriado, simulando as condições fisiológicas. O técnico então colocará os espermatozoides previamente capacitados em contato com os oócitos, quando ambos estiverem prontos para a fertilização. Usualmente, os ovócitos iniciarão o processo de clivagem realizando sucessivas divisões até chegar a 32 ou 64 células, atingindo então o estado de mórula compacta e depois blastocisto. Durante esse período, os embriões são mantidos em placas no laboratório, em uma mistura de nutrientes e condições que simulam o ambiente da tuba uterina. Usando cateter especial, os embriões serão implantados dentro do útero das fêmeas receptoras no 7º dia de desenvolvimento. Essas fêmeas, que também atuarão como “barriga de aluguel”, são sincronizadas por meio de protocolos hormonais para estar exatamente nessa fase do ciclo estral (7º dia após a ovulação).

Também dentro das técnicas de FIV podemos citar a injeção intracitoplasmática de espermatozoides – ICSI, que oferece um tratamento viável mesmo para os mais difíceis casos de infertilidade masculina; já é bastante utilizada na espécie humana. Ela também é uma técnica de fertilização in vitro, porém de uso mais limitado e ainda experimental. A ICSI possibilitou a fertilização de óvulos com espermatozoides que podem ser aspirados do epidídimo ou diretamente dos testículos, mediante uma minúscula biópsia.

Quarta geração: clonagem e transgênicos

Consideradas biotecnologia de 4ª geração, as técnicas de clonagem e transgênicos em animais domésticos ainda estão etapa experimental; sua possível aplicação em seres humanos também é questionada do ponto de vista ético. Em animais de interesse zootécnico, essas técnicas já foram realizadas de forma experimental com sucesso em várias espécies, mas ainda não viabilizadas para uso comercial, em função de seu custo-benefício e de resultados variáveis em termos de índice de sucesso. A clonagem animal pode ser realizada de duas formas:

1. Através da divisão de uma mórula única para originar dois embriões gêmeos (isto é, com idêntica carga genética) mediante métodos microcirúrgicos. Essa é uma técnica mais simples, já bastante utilizada e padronizada em diversas espécies de mamíferos;
2. Através da transferência nuclear, mediante a qual se transfere a um ovócito "desnucleado" um núcleo diploide (proveniente de uma célula somática); esse é um procedimento bem mais complexo do que o primeiro. Essa técnica induz, por um lado, a ativação do ovócito e, por outro, a desdiferenciação do genoma, a qual lhe outorga pluripotencialidade.

Esse procedimento, já testado com êxito em mamíferos, abre possibilidades terapêuticas e produtivas muito amplas, porém é também um campo polêmico do ponto de vista ético, sociológico e religioso. Em animais, tal técnica já é viável, porém com ocorrência de diversas perdas e/ou malformações, havendo pequeno percentual de sucesso (cerca de 5% em todo o processo) de animais saudáveis que vêm a nascer e sobreviver com saúde após o parto. Dessa forma, a aplicação dessa técnica para ainda é bastante restrita. Para saber mais sobre o uso da clonagem animal, vale a pena ler o trabalho de Salvador (2019).

Considerações finais

Nos últimos 50 anos os especialistas em Biotecnologia da Reprodução têm criado e aperfeiçoado inúmeras técnicas para atenuar as deficiências reprodutivas ou potencializar a capacidade reprodutiva nas espécies humana e animal. Os reflexos e impactos da aplicação das biotecnologias da reprodução animal de primeira geração aceleraram a capacidade de melhoramento genético com foco em multiplicação de material genético dos machos. Hoje, com o uso dessas biotecnologias de primeira geração (inseminação artificial, criopreservação de sêmen, separação de espermatozoides X e Y), a genética de um reprodutor pode se espalhar em milhões de crias de alto potencial zootécnico. As tecnologias de terceira geração (produção de embriões in vitro) têm proporcionado às fêmeas de determinado rebanho potencial semelhante de multiplicação. Com a produção in vitro de embriões (PIVE), as fêmeas agora não se limitam mais a produzir somente um número limitado de crias que poderão gestar, mas dezenas ou até mesmo centenas de crias ao ano a partir do seu material genético em acasalamento com reprodutores também de alto potencial genético. As biotecnologias da reprodução de 4ª geração vislumbram ainda mais novas possibilidades, porém estas ainda estão em fase experimental e desenvolvimento, com resultados ainda insatisfatórios para viabilidade e uso comercial. Apesar do uso comercial intensivo na pecuária das biotecnologias da reprodução animal de 1ª, 2ª e 3ª gerações, seus impactos e consequências ainda estão sendo mensurados, bem como as novas possibilidades para melhoria do manejo e eficiência reprodutiva das diversas espécies.

Referências

BARUSELLI, P. S. et al. Evolução e perspectivas da inseminação artificial em bovinos. Rev. Bras. Reprod. Anim., v. 43, nº 2, p. 308-314, abr./jun. 2019.

GONÇALVES, R. L. R.; VIANA, J. H. M. Situação atual da produção de embriões bovinos no Brasil e no mundo. Rev. Bras. Reprod. Anim, v. 43(2), p. 156-159, 2019.

GONÇALVES, P. B. D.; FIGUEIREDO, J. R.; FIGUEIREDO FREITAS, V. J. Biotécnicas aplicadas à reprodução animal. São Paulo: Roca, 2008.

HAFEZ, E. S. E.; HAFEZ, B. Reprodução animal. 7ª ed. Philadelphia: Lea & Febiger, 2004.

MORANI, E. S. C.; RODRIGUES, L. H.; RONCOLETTA, M. Manual de reprodução nas espécies domésticas – avaliação e empregabilidade do sêmen, v. 1. São Paulo: Medvep, 2018.

PALHANO, H. B.; JESUS, V. L. T.; TRÉS, J. E.; JACOB, J. C. F.; MOREIRA ALVES, P. A. Reprodução em bovinos – fisiopatologia, terapêutica, manejo e biotecnologia. 2ª ed. São Paulo: Roca, 2008.

RODRIGUES, J. L.; RODRIGUES, B. A. Evolução da biotecnologia da reprodução no Brasil e seu papel no melhoramento genético. Rev. Ceres, v. 56, nº 4, p. 428-436, 2009.

SALVADOR, Daniel Fábio. Impactos da biotecnologia – clonagem animal. Educação Pública, v. 19, nº 24, 8 de outubro de 2019. Disponível em: https://educacaopublica.cecierj.edu.br/artigos/19/24/impactos-da-biotecnologia-clonagem-animal.

STEPTOE, P. C.; EDWARDS, R. G. Birth after the reimplantation of a human embryo. Lancet, v. 2(8085), p. 366, 1978.

VIEIRA, Rômulo José. Biotécnicas aplicadas à reprodução bovina: generalidades. Ciência Animal, v. 22(1), p. 55-65, 2012.